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使用Infinite200酶标仪测定核酸浓度的方法

一、光吸收法
DNA的紫外吸收高峰为260nm,吸收低峰为230nm,而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm
 
OD260nm/ OD230nm2OD260nm/ OD280nm1.8,表示RNA 已经除净,蛋白含量不超过0.3%。
 
用这种方法适合测定GC含量比较均匀的基因组DNA,人工合成的寡核苷酸如果CG含量过大或者过小,就不能采用此方法。
双链DNA浓度的计算:
 

        OD260nm260nm 处的光吸收值;L 为光程(cm);0.020 1μg/mL DNA 钠盐的光密度。
 
由于这种方法无法区分核酸种类和核苷酸,故此对于不纯的样品准确性不高,如果需要精确定量双链DNA的浓度,请采用荧光染料测定DNA的方法。
 
(一)   使用酶标板:
 
优点:通量大;
缺点:不易获得准确的光程;需要较高的样品浓度和较大的样品体积。
 
使用酶标板检测DNA,必须使用能够透过紫外光的UV板,普通酶标板是不能使用的。
 
市场上常见的两个品牌CostarGreiner都有UV板,它们是有区别的:CostarUV板只能做260nm-280nm的光吸收检测,波长低于260nm时板的本底光吸收会随波长降低不断增加GreinerUV Star板在230nm-280nm范围内吸收值大致相同,故此可应用范围更宽泛。
 
UV板在260nm有大约0.05OD的光吸收,按100ul的检测体积计算,相当于10ug /ml dsDNA,按照酶标仪检测的一般原则,样品的OD值需要为本底的3倍以上才可信,就是核酸样品的260nm光吸收值必须大于0.150OD,这样就要求100ul核酸样品的浓度不低于30ug/ml,如果检测体积减小,这个浓度还需要继续加大。
 
          

1Costar96UV板的光吸收谱
 
 
1、酶标板的选择:
 
DNA样品的体积一般是有限的,如果过度稀释将无法在酶标仪上检测。要避免过度稀释,可使用384UV板进行检测,需要15ul-20ul样品直接检测或稀释数倍后检测,也可使用half area 96UV板进行检测,需要20ul-80ul的样品,样品浓度仍需大于30ug/ml
 
CostarGreiner都提供384孔和half area 96UV
384Greiner UV-Star Cat.No. 781801Costar UV Cat.No. 3675
Half area 96Greiner UV-Star Cat.No. 675801Costar UV Cat.No. 3679
 
其中我们推荐使用Greiner UV-Star 96Half area板,因为它是一种可确定光程的板,80ul样品的光程是0.5cm170ul样品的光程是1cm。此种板国内一般无库存,需要提前订货。
 

图2:Greiner UV-Star 96Well Half area 的几何尺寸
 
2、光程的确定
 
光程就是测定时光线穿过样品的距离,它与测量获得的光吸收值(OD值)成正比,要计算核酸浓度,必须知道测量的光程。由于酶标板的孔一般是半圆锥型的,上下截面的直径是不等的,所以使用酶标板测量DNA时,样品的光程是难以计算的。
 
常用的酶标板光程计算,是利用水在977nm998nm下的吸收峰,来计算水溶液的光程。水在977nm-998nm有吸收峰,在900nm几乎无吸收。先利用分光光度计测出1cm光程的水在977nm998nm900nm的光密度差,再与酶标板上测得的差值比较,就可以估算出每个孔的光程了。
 
下面是光程计算公式:
           
 
A977:水溶液样品在977nm的吸光值
A900:水溶液样品本底
Awatercm-11cm光程比色杯中水的吸光度值 A977 )-本底值 A900
 
光程测量法只能在光栅型酶标仪上使用,比如Infinite M200/M1000,由于水在977nm998nm 下的吸收值本来就不大,这种方法误差相对来说就比较大。
 
也可以采用标准曲线法计算样品浓度从而避免测量光程;或者采用某个已知浓度、特征吸收峰和光密度的样品去估算光程(可以和分光光度计的测值比对,或者通过核酸浓度进行换算)。
 
(二)   使用比色皿:
 
优点:对样品浓度的要求低;
缺点:需要较大的样品体积,通量低。
 
如果M200酶标仪具有比色杯模块,可使用微量石英比色皿测定样品核酸浓度。由于M200的比色杯模块测量狭缝的尺寸限制,样品体积一般不能低于100ul,光学性能好的石英比色皿260nm本底吸收在0.01-0.04OD,大约相当于0.5-2.0 ug /ml dsDNA,低浓度的DNA样品可测量。
 
        如果酶标仪不具备比色杯模块,也可以使用卧式微量石英比色皿来检测DNATecan的酶标仪配置了卧式比色皿的适配器,但卧式比色皿需要的样品体积较大,需要200-400ul
 
(三)   Nanoquant
 
优点:需要样品少,通量较大;
缺点:样品浓度不可过低。
 
NanoQuantTecan公司开发的利用Infinite200酶标仪光吸收测量功能检测微量体积(2ul)核酸样品的工具模块,样品不需要稀释直接检测,每次最多可检测16个样品。
NanoQuant板在260nm的本底吸收约为0.05ODNanoQuant模块的检测下限为1ug /ml dsDNA
NanoQuant模块包括NanoQuant板一块、辅助加样器一个。
 

         
3NanoQuant模块
 
       Nanoquant模块的使用方法另作详述。
 
二、荧光法
 
使用与核酸结合的荧光染料测定DNA荧光方法灵敏度高,特异性好,如PicoGreen灵敏度可达250pg/ml,能区分DNARNA,区分核酸和核苷酸,需要样品量少。荧光法的缺点是需要做标准曲线,荧光染料需要一定的成本,得不到A260nm/ A280nm值。
 
常用染料品种:
PicoGreenInvitrogen生产的dsDNA定量染料KitMolecular Probes P-7589)
SYBRGreen I:激发波长497nm,发射波长520nm,用于核酸凝胶电泳染色和荧光定量PCR,价格便宜,直接用于酶标检测DNA本底较PicoGreen高,灵敏度需实验确定。
 
附:
DNASYBR Green I荧光定量方法
 
原理: SYBR Green I荧光染料与 DNA双链具有高亲和力,结合后荧光强度可增加800-1000倍;在溶液中SYBR Green I过量时,荧光强度与双链DNA浓度成正比。因此可用于溶液中 dsDNA 的定量,为核酸的高灵敏度检测提供了一种新的方式。
 方法:
1.      SYBR Green I储存液(10000×,Molecular Probescatalog number S7563)用DMSO稀释至200×,再用1×TE10mM Tris-Cl1mM EDTApH 7.5)稀释至2×;
2.      DNA标准品的稀释:已知浓度的纯化的DNA均可作为标准品。将标准DNA稀释为三个浓度:10ng/ml100ng/ml1000ng/ml。若能根据经验估计出待测样品DNA的大致浓度,则省去4-6步。
3.      待测DNA的稀释:将待测样品用1×TE进行梯度稀释,稀释2-3个浓度。
4.      加样:黑色平底96孔板(GREINER,)的每孔中加入100μl 2×SYBR Green I100μl标准品稀释液(或待测DNA稀释液,以TE代替样品作为空白对照),混匀;室温避光孵育2-5分钟。
5.      放入TECAN多功能酶标仪中,设置好参数进行测量,测量结果保存,进行数据分析。
6.      根据减去背景后的荧光值估计出样品DNA的大致浓度(荧光值与浓度成正比),将标准DNA适当范围内进行梯度稀释。
7.      重复4-6步测量。
 注意事项:
1.      标准DNA和样品的稀释度均应在1×SYBR Green I测量的线性范围内(10-1000ng/ml),否则测量结果不准确;样品浓度在1-10ng/ml范围内时,用终浓度为0.2×的SYBR Green I测量;DNA浓度<1ng/ml时,不宜用SYBR Green I方法测量。
2.      SYBR Green I的稀释应在塑料容器中进行,不要在玻璃容器中进行,因为玻璃表面可吸附染料;SYBR Green I见光易分解,因此工作液要避光,而且在稀释后的几个小时内尽快用完,不要长期保存。
3.      用来作标准曲线的DNA与待测DNA的纯化方式应尽量相同,以确保溶液内其他组分(盐、有机溶剂、蛋白等)一致,使测量准确。
4.      较高的样品DNA稀释浓度可减小其他污染(盐、有机溶剂、蛋白等)的干扰。
准备的试剂SYBR Green I200×)100 μl
1.      根据用量将SYBR Green I用蒸馏水稀释至1×。
2.      加样:每孔加入90μl 1×SYBR Green I10μl待测样品溶液或标准品溶液,先根据标准品浓度判断样品的大体浓度范围。若样品浓度很低(110ng/ml)则用0.2×SYBR Green I测量。